Метилирование ДНК в нормальных клетках

Медицина и образование / Роль метилирования ДНК в канцерогенезе / Метилирование ДНК в нормальных клетках

Для понимания роли метилирования при канцерогенезе необходимо знание закономерностей протекания этого процесса в нормальном организме. Клетки млекопитающих обладают способностью эпигенетически модифицировать свой геном путем энзиматического по пятому положению метилирования остатков цитозина в составе 5/-CpG динуклеотидов. Цитозиновый остаток в составе 5/-GpC или любых других динуклеотидов не метилируется. Приблизительно 70-80% CpG динуклеотидов в геномах млекопитающих метилированы (Baylin S.B., et al, 1998). Одновременно, их распределение в ДНК является не случайным, и, в целом, геномы обеднены по отношению к CpG динуклеотидам (Antequera F. & Bird A., 1993). Предполагается, что именно метилирование сыграло в этом критическую роль. 5-МеС в составе CpG динуклеотидов гипермутабилен, поскольку аминогруппа в шестом положении цитозинового кольца крайне нестабильна. 5-МеС может легко подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием тимина. Это обстоятельство вело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G-C на А-Т, в результате чего динуклеотидов CpG в составе ДНК приблизительно в 5 раз меньше (~1 CpG на 80 динуклеотидов), чем следовало бы (1 на 16) (Gardiner-Garden V. & Frommer M., 1987). Существуют два вида распределения CpG динуклеотидов в составе ДНК млекопитающих. Первое - это рассеянные CpG (их ~80% от общего количества). Они рассредоточены по всему геному в виде одиночных динуклеотидов, причем особой закономерности в их распределении выявить невозможно. Чаще всего они встречаются в интронах и намного реже в транскрибируемых областях. Значительная часть тканеспецифичных генов имеют в своих промоторах одиночные CpG. Степень их метилирования может быть различной в разных клетках и тканях (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Второй вид распределения заключается в следующем. В геномах млекопитающих существуют короткие (от 500 до 5000 пар нуклеотидов) последовательности, где CpG динуклеотиды распределены кластерами. Плотность их близка к расчетной (1 на 16), а содержание G + C превышает 60%. Такие последовательности получили название CpG-островков. Характерным свойством этих структур является их частая локализация в 5/-регуляторных районах генов, но они также встречаются и в интронах, а также на 3/- концах генов. Свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека, содержат CpG-островки. К их числу относятся, по-видимому, все гены домашнего хозяйства, около 40% тканеспецифичных генов, многие протоонкогены и гены супрессоры опухолевого роста. CpG-островки, ассоциированные с регуляторными областями генов, неметилированы во всех тканях эмбриона и взрослого организма (включая и гаметы), независимо от того, экспрессируются в них гены или нет. Исключение составляют только гены, расположенные на инактивированной Х-хромосоме у самок, а также импринтированные гены, которые экспрессируются только с одного из двух аллелей, материнского или отцовского. У этих генов в нормальных клетках CpG-островки метилированы (Baylin S.B., et al, 1998; Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Кроме того, большую часть генома млекопитающих (~95%) составляет генетический балласт или junk ДНК, участки которой, подвергаются интенсивному метилированию. Например, к числу последовательностей, обогащенных CpG динуклеотидами, относятся транспозоны (~25% генома человека) и сателлитные повторы (~10% генома человека). Эти паразитические элементы метилированы во всех изученных сайтах генома нормального взрослого организма (Selker E.U., 1999). Подобным же образом в нормальных клетках грызунов и человека интегрированные вирусные последовательности подвергаются метилированию и обусловленному им стабильному блоку транскрипции (Walsh C.P., et al, 1998). Паттерн метилирования конкретных генов и генома в целом устанавливается в процессе эмбриогенеза и стабильно сохраняется в популяциях соматических клеток взрослого организма. Так, вскоре после оплодотворения, на стадии 1-2 клеточных делений, происходит тотальное деметилирование генома, устраняющее паттерн исходных половых клеток. Деметилированное состояние ДНК сохраняется до стадии имплантации бластоцисты (Razin A. & Shemer R., 1995). На постимплантационной стадии начинается процесс метилирования de novo, когда большинство CpG-сайтов вновь метилируется, за исключением тех, что находятся в составе CpG-островков (Tuker M.S., 1999). Механизм, позволяющий CpG-островкам избегать метилирования de novo в эмбриогенезе, пока неизвестен. Предполагают, что защитную роль в этом процессе играют специфические цис-действующие генетические элементы. В настоящее время такая функция доказана для последовательности, являющейся одновременно сайтом узнавания транскрипционного фактора Sp1 (Tuker M.S., 1999). Позднее, в процессе дифференцировки происходит локальное деметилирование индивидуальных генов. В результате этих последовательных событий 70-80% CpG-сайтов в геноме человека и мыши оказывается метилированными. Сформированный профиль метилирования затем сохраняется в ряду клеточных поколений. Поддерживающее метилирование осуществляется только в тех сайтах вновь синтезированной цепи ДНК, где в исходной цепи уже содержались CpG динуклеотиды с метилированным остатком цитозина (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). В настоящее время у млекопитающих, включая человека, известны четыре фермента, осуществляющие метилирование геномной ДНК. Это ДНК-метилтрансферазы: Dnmt1, Dnmt2, Dnmt 3a и 3b (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001; Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Dnmt1 - наиболее изученный на сегодня фермент системы метилирования ДНК у позвоночных. Гомозиготная делеция dnmt1 у мышей приводит к летальному исходу на стадии эмбриона (Li E., et al, 1993). Именно это наблюдение явилось доказательством необходимости метилирования ДНК у высших эукариот. В структуре Dnmt1 были выявлены два домена: каталитический и регуляторный. Каталитический домен локализован в С-концевой области белка и структурно близок к бактериальным цитозиновым метилтрансферазам. В свою очередь, регуляторный домен расположен в N-концевой части Dnmt1 и содержит специальную сигнальную последовательность, направляющую фермент в активные репликативные комплексы делящихся клеток (Bestor T.H. & Verdin G.L., 1994). Активность фермента резко возрастает с началом синтеза ДНК и в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити воссоздается по образцу материнской. Dnmt 3a и 3b, как оказалось, необходимы для метилирования de novo (Okano M., et al, 1998a). Инактивация соответствующих генов несовместима с развитием зародыша у мыши. Ферменты экспрессируются на высоком уровне в эмбрионах и на очень низком в соматических клетках взрослого организма. Эти ферменты различаются по своим функциям, так как только Dnmt3b небходима для метилирования центромерных минисателлитных повторов (Okano M., et al, 1999). Функции Dnmt2 остаются пока неясными (Okano M., et al, 1998b). В настоящее время ничего не известно и о том, как происходит тотальное деметилирование генома в эмбриогенезе. Только совсем недавно была открыта ДНК-деметилаза, которая по своим свойствам является весьма вероятным кандидатом на роль фермента, осуществляющего тотальное деметилирование. ДНК-деметилаза способна узнавать метилированные CpG динуклеотиды и трансформировать 5-МеС в цитозин, не нарушая целостности ДНК (Bhatacharya S.K., et al, 1999). Что касается механизма локального деметилирования, то для нескольких тканеспецифичных генов установлено, что этот процесс контролируется определенными цис-действующими генетическими элементами, которые узнаются специфическими транс-действующими белковыми факторами (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001). Метилирование подавляет экспрессию на уровне транскрипции. Существует, по крайней мере, два механизма, с помощью которых метилирование может препятствовать транскрипции. Один из них заключается в прямом ингибировании связывания специфических транскрипционных факторов (c-Myc/Myn, AP-2, E2F и ATF/CREB-подобные белки), чьи сайты узнавания содержат одиночные метилированные CpG динуклеотиды (Robertson K.D. & Jones P.A., 2000). Второй механизм репрессии опосредуется через метил-CpG связывающие белки, такие как MeCP1 и MeCP2, известные также как MBD-семейство (Boyes J. & BirdA., 1992). Они не проявляют специфичности к последовательности немодифицированных нуклеотидов, но обладают высокой степенью родства к метилированной ДНК. Наиболее изученный из них, MeCP2 локализуется в ядре в гетерохроматине (неактивен, конденсирован, реплицируется в поздней S-фазе). Структура белка включает 2 домена: один связывает метилированные CpG, второй обеспечивает функции репрессора транскрипции. Взаимодействуя с метилированными основаниями, MeCP2 рекрутирует корепрессорный комплекс mSin3a/HDAC (гистондеацетилаза), который осуществляет деацетилирование N-концевых аминогрупп гистонов. В результате гистоны приобретают дополнительный положительный заряд и способность прочно взаимодействовать с витками нуклеосомной ДНК. Нуклеосомы компактизуются и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции. Напротив, рекрутирование в комплекс с транскрипционными факторами белков с гистонацетилазной активностью (НАТ) способно снимать репрессирующее действие метилирования, приводя к образованию эухроматина (деконденсирован, потенциально активен, реплицируется в ранней S-фазе) (Лихтенштейн А.В. & Киселева Н.П., 2001; Spencer T.E., et al, 1997). Таким образом, наряду с формированием репрессивных комплексов на основе обычных белков - репрессоров, узнающих специфические последовательности, высшие эукариоты с усложненным геномом обладают дополнительным уникальным эпигенетическим механизмом регуляции транскрипции, который наследуется дочерними клетками при делении.